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发稿时间：2020-10-19来源：天昊生物

英文题目：the fam171a2 gene is a key regulator of progranulin expression and modifies the risk of multiple neurodegenerative diseases

中文题目：fam171a2基因是颗粒蛋白前体(progranulin, pgrn)表达水平的关键调控因子并影响多种神经退行性疾病发病风险

发表期刊：science advances

影响因子：13.116

发表单位：青岛市市立医院、复旦大学附属华山医院的谭兰教授-郁金泰教授团队

●颗粒蛋白前体(progranulin, pgrn)在中枢神经系统（cns）和外周组织中表达。pgrn不足已经证明和额颞痴呆、阿尔兹海默症和帕金森疾病发生发展有关。功能缺失动物模型揭示了pgrn不足的潜在发病机制可能涉及神经炎症、自噬和细胞信号传导。pgrn过表达可防止病理蛋白沉积和毒性，以及抑制ad和pd样疾病模型的表型进展。最近，在ad的进展过程中发现脑脊液（csf）中pgrn水平不断增加。这些证据表明，pgrn失调可能参与了神经退行性疾病的发病机制，可能是一个很有前景的的治疗靶标。

●越来越多的证据表明，pgrn水平可能会被基因变异所调控，但到目前为止，尚没有全基因组关联研究(gwas)揭示中枢神经系统中pgrn的遗传调控因子。

●寻找中枢神经系统pgrn调节遗传位点具有极其重要的意义，特别是考虑到（一）pgrn水平在外周血和中枢神经系统中的调控方式可能不同。(二)增加pgrn水平作为神经保护的方法可能受其促进癌变和肥胖等外围作用的阻碍。

●本研究旨在确定csf 中pgrn水平的遗传调控因子。

●发现样本：432例(hc = 157, mci = 275)非西班牙裔白人的非痴呆表型样本，来源于alzheimer’s disease neuroimaging initiative go/2 (adni-go/2)数据库(adni.loni.usc.edu)，纳入的样本经过了人群分层和亲缘关系的样本质控。

●csf pgrn检测：使用meso scale discovery平台进行三明治免疫分析检测

●基因分型：human omniexpress beadchip (illumina inc., san diego, ca)，基因型填补和质控后，共纳入3,262988个snp进行后续分析。

●统计分析：csf pgrn水平经过正态转化后，基于加性模型进行snp位点的线性关联分析。逐步线性回归用于筛选需要进行矫正的临床相关变量（p<0.2的纳入）。

本研究的目标是探究csf pgrn水平的遗传调控因子，进一步解析pgrn在神经退行性疾病相关通路中的作用。本研究第一阶段基于adni数据库432例无痴呆表型样本的遗传信息和csf pgrn水平进行了gwas研究，第二阶段在930例中国无痴呆表型的样本中进行验证。

◆csf prgn水平受性别、教育水平和apoe e4影响

在gwas人群中，csf pgrn水平显著受性别影响 (p = 3.87 × 10−5, beta = 0.003)，可能受 apoe e4 allele (p = 0.08, beta = −8.73 × 10−4) 和教育水平影响(p = 0.12, beta = −1.77 × 10−4)。 csf pgrn 与年龄或临床诊断无关（健康hc/轻度认知障碍mci）。

◆fam171a2基因常见变异与csf pgrn水平有关

校正年龄，教育水平，apoe e4，人群分层的前三个主成分后，17号染色体上共有18个位点与csf pgrn水平显著相关（fam171a2上5个位点, itga2b上12个位点,  grn的rs5848位点)（具体位点见下方的table2）。其中，fam171a2上的rs708384关联程度最高（p=5.09×10-12）（图1ac）。这个位点位于 fam171a2基因1号内含子的转录因子结合区，该位点经置换检验校正后仍显著（0.0002）(图1b)。控制了rs708384的影响后，其它top位点的显著性消失（p>0.1）,提示17号染色体的强显著关联主要由rs708384驱动(图1d)。

◆亚组分析与敏感度分析

在针对性别、初始诊断亚组分析中，fam171a2 rs708384位点的低频碱基（a）与低csf pgrn均显著相关（图2a）。敏感度分析中，在进一步矫正了年龄、初始诊断、rs5848的影响后，rs708384与pgrn水平相关性仍然显著（p=3.51×10-12）。剔除初始采样后3年内发展为ad的样本，rs708384仍然为top位点（n=359,p=4.73×10-10）。基于aβ病理状态分组后，rs708384在各组仍显著。

◆pgrn关联位点的特异性

考虑到这种相关性可能受其它神经退行性疾病蛋白的影响，纳入了ab42, t-tau, p-tau, a-synuclein (a-syn), neurofilament light chain (nfl),和secreted triggering receptor expressed on myeloid cells 2 (strem2)的脑脊液水平作为协变量，相关性并没有受影响。相关性分析只发现csf pgrn与t-tau，a-syn,nel和strem2水平存在弱相关性。且rs708384与以上所有其它蛋白水平均无相关性。这些结果提示pgrn关联位点的特异性。

◆遗传位点对csf pgrn水平变异度的解释度

17号染色体上所有位点对csf pgrn水平的解释度为17.4%，grn基因位点的解释度为13.3%，rs708384解释度为9.1%。

◆独立样本验证与meta-analysis

研究者在930例北方汉族人群中检测了csf pgrn水平和rs708384基因型，结果提示rs708384位点的a碱基与低csf pgrn仍然显著相关（矫正年龄，性别，教育水平，apoe e4， mmse基线水平和cv，p=7.47×10-9）（图2b）。rs5848也与pgrn显著相关，但矫正rs708384的影响后，显著性消失（p=0.88）。但矫正rs5848的影响后，rs708384与pgrn的相关性能达到边缘显著性水平（p=0.1）。矫正rs5848和其它变量后，rs708384在加性模型下与pgrn显著相关（p<0.05）。这些结果提示rs708384与csf pgrn的相关性不受rs5848影响。meta分析也进一步证明了这种相关性（p=1.74×10-18）。前期报道的血液pgrn调控遗传位点与csf pgrn并无显著相关性，提示外周系统和cns系统的pgrn遗传调控机制是不同的。

◆fam171a2阳性位点的功能注释

增强子富集分析表明，rs708384与连锁位点在特定的脑区增强子区显著富集（如中海马、下颞叶和前额叶)。提示这些变异可能在这些部位调控基因表达。研究者还发现fam171a2在ad患者和对照颞叶皮层中的表达有明显差异(p = 0.004)。此外，表达定量性状位点(eqtl)分析显示，rs708384(z=4.74；p=2.5×10-6)及其一些连锁位点可能会影响grn在血液和特定的大脑区域中的表达。此外，除了grn，rs708384也与多个部位的fam171a2和itga2b表达有关。这些证据共同提示以下假设：rs708384，位于tf结合位点，可能会在功能上调节grn和下游fam171a2基因的表达。grn和fam171a2的表达水平在血液和脑组织中都显著相关。

◆fam171a2与grn基因属于相同通路

针对显著位点，panther富集出96个通路，cpdb富集出107个通路，交集共有34个。这些通路与神经系统发育，分子运输，信号转导，细胞-细胞连接和刺激响应有关。基因网络分析提示有31个富集通路，共有4个聚类（图3b）。最显著的三个基因（grn,fam171a2和itga2b属于同一个聚类）。针对这个聚类的go分析，检测到了上述提到的通路，同时还有2个新通路：血压调控和白细胞介素8的分泌。在16条显著通路中[12条来自reactome，4条来自kegg]，l1细胞粘附分子（l1cam）相互作用途径是最显著的(reactome，p=2.49×10-6)，高z值主要是因为fam171a2和grn基因的存在（图3c）。其他大多数重要途径也主要与细胞间的相互作用有关。

◆基于小鼠的免疫荧光和免疫组化检测，fam171a2主要在中枢血管上皮和胶质神经细胞表达（图4）。

◆rs708384在体外调控fam171a2和grn基因表达

在hek293细胞系进行双荧光报告检测，证明c到a碱基的突变显著增加了fam171a2的表达水平。在人脐静脉内皮细胞系进行fam171a2过表达后，pgrn水平显著下降，fam171a2敲降后，pgrn水平显著上升。

◆rs708384对神经退行性疾病表型的影响

基于adni数据库的分析，rs708384的aa基因型与更高的csf tau水平、更差的整体认知能力有关。10个与rs708384高连锁的snp（r2>0.8）在多项大型gwas研究中与ad,pd和ftd的发病有关，且a基因型都与高风险有关。

基于csf pgrn水平开展的gwas研究，研究者成功地发现了一个fam171a2基因区域内的独立位点，显示了与csf pgrn水平的全基因组显著关联。基于遗传、分子和生物信息多层面的分析提示，fam171a2基因是一个csf pgrn表达水平的关键调节器，并能改变神经退行性疾病的风险。

●本文发现的这一基因组显著性水平关联信号应该是真实和特异的，相关证据主要包括：1）rs708384是一个直接分型成功而非填补预测的snp位点，显著性水平达到全基因组显著性水平，并且在多重矫正后仍然显著；2）这个位点成功在更大的独立样本群中获得了验证；3)生信分析和体外实验均证实该位点可以调控grn和fam171a2基因的表达；4) grn和fam171a2基因在基因组上紧密相连，可能在脑组织中存在功能相关性；5）rs708384基因型与csf一些标志物和神经退行性疾病的发病风险相关。

●本研究的一些不足：1）验证样本组为医院来源的汉族人群，后续需要在其他种族的社区队列中验证这种关联。2)作为gwas分析阶段的一个关键协变量，rs5848是由基因型填补得到的，没有进行基因分型。但本研究提出了多种证据提示这个位点引入偏差的风险较低。1在ceu人群中，rs5848与rs708384的连锁度为低-中度，说明潜在的影响因素有限；2一致性检验显示， rs5848的填补精度很高（n = 427，kappa = 0.874）；3 rs708384与csf pgrn关联水平仅受rs5848的轻微影响。3）体外证据表明，rs708384可能会影响到fam171a2的表达，而该基因与pgrn基因的表达存在紧密关联。然而具体机制还有待研究。在接下来的研究中，需要进一步研究fam171a2调控pgrn的具体机制。将重点研究fam171a2在小胶质细胞内和各种神经退化疾病模型中对pgrn表达中的作用。4）需要进一步明确top snp位点对csf pgrn的影响大小是否因诊断组而异，因为本研究仅仅纳入的是没有痴呆症的个体。

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