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发稿时间：2021-04-02来源：天昊生物

paget’s骨病（pdb）是一种慢性进展性代谢骨病，以破骨细胞的异常激活为特征，导致骨吸收增加和代偿性骨形成、骨硬化。pdb能够影响骨骼的某个或多个区域，伴有多种临床表现，包括骨痛、骨骼和关节畸形、病理性骨折、耳鸣、听力下降以及视力丧失等。

骨肿瘤是pdb最严重的并发症，其中最常见类型为骨肉瘤，发生率为1%，其风险增加是普通人群的数千倍。其次还可并发纤维肉瘤、软骨肉瘤以及骨巨细胞瘤（giant cell tumor，gct），其中合并gct非常罕见，并且这一疾病的发病机理仍不明确。

遗传是pdb发病的重要因素之一，报道发现sqstm1、tnfrsf11a、tnfrsf11b、vcp、hnrnpa2b1等基因的突变与pdb相关。znf687曾被报道与意大利南部几例pdb/gct患者有关，然而，pdb和pdb/gct的分子机制仍未完全解析，上述的已知基因只能解释其中一小部分病例。

课题组于2017年和2019年分别收集到两个早发型pdb伴gct（pdb/gct）家系样本，其中家系一包含祖孙三代24位成员，10位成员以常染色体显性方式被诊断为pdb（图1，诊断资料详见原文），所有的患者呈现出pdb多骨侵犯（至少3个部位骨骼受累），并且发病年龄呈早发型。家系二包括母子两代4位成员，先证者和其母亲以常染色体显性方式被诊断为pdb（诊断资料详见原文）。这项研究同时纳入了30例pdb散发患者，这些患者均未检测出与pdb相关的已知基因突变。研究另外招募了570名健康汉族人群志愿者作为对照，检测健康人群中的突变频率。

为了发现pdb/gct的致病基因，研究人员对家系一15位成员进行连锁分析，并对患病的6位成员（ii-2、ii-4、ii-5、ii-9、iii-4和iii-9）进行全外显子组（wes）测序。多点参数连锁分析在染色体17：8、547-5、657和423的lod分数最高，为2.70（图2a）。研究通过wes鉴定出73个功能变异，但只有2个在关键连锁区域内。进一步通过sanger测序发现只有1个与疾病表型显示出精确的共分离：pfn1基因的c.318_321deltgac杂合突变（p. asp107argfs*3），编码profilin 1蛋白，该基因位于染色体17p13（图2b）。该突变位点4bp的缺失会导致一个提前终止密码子的移码突变，形成一个由108个氨基酸而不是140个残基组成的蛋白。研究人员又利用sanger测序在1例散发患者中发现了pfn1基因的另一个相邻位置的缺失突变（图2b），c.324_324delg杂合突变（p.t109rfs*2）。而在家系二成员（i-2）中鉴定到pfn1的c.335 t > c错义突变（p.leu112pro，图2b），这些研究结果表明pfn1的截短型突变和错义突变均是pdb/gct的致病突变，而在健康对照中并未发现以上类型的突变。

接下来研究人员在113例单纯gct患者的肿瘤样本中分析pfn1基因是否存在体细胞突变，结果并未检测出pfn1体细胞突变存在。为了验证患者的破骨细胞是否具有典型的pagetic破骨细胞特征，研究人员分别从健康对照和患者（家系一iii-9）的外周血中分离出单个核细胞，并将其向破骨细胞诱导分化。正如预期，研究人员观察到pfn1突变的pdb患者破骨细胞数量及大小远高于对照组（图3）。

为了研究pfn1突变在pdb发病机制中的功能，利用crispr-cas9技术构建了pfn1突变小鼠，pfn1 c.318–321缺失纯合突变对于小鼠胚胎形成是致死的，pfn1 ^/mut小鼠与野生型（wt）小鼠相比，突变小鼠从出生到成年，体型较野生型更小，体长和股骨长度缩短，颅面骨和脊柱表型明显差异（图4a）。micoct 3d重建显示与wt小鼠相比，pfn1 ^/mut小鼠的颅缝较宽，颅面骨和脊柱后凸畸形（图4b）。另外，pfn1 ^/mut小鼠骨小梁参数显示较wt骨量明显减少（图4c）。

为了进一步评估pfn1突变是否影响破骨细胞分化，分离wt和pfn1 ^/mut小鼠骨髓巨噬细胞，诱导其分化成破骨细胞。研究发现，pfn1 ^/mut小鼠的破骨细胞数量显著高于wt小鼠 （图5a, c）。

此外，吸收陷窝形成实验显示，来自pfn1 ^/mut小鼠的破骨细胞形成的吸收陷窝更大、更深，骨吸收能力更强（图5b）。这表明该突变导致破骨细胞的骨吸收活性明显增强，这与pdb患者活跃的骨吸收表型一致。

骨转换标志物反映骨形成和骨吸收的活性。通过elisa检测了p1np和tracp-5b的表达水平，结果显示与wt小鼠相比，pfn1 ^/mut小鼠的p1np和tracp-5b均显著升高（图5d），表明pfn1 ^/mut小鼠骨转换活跃。这也与pdb患者骨吸收活性增强相一致。

另外，采用he染色比较8周龄小鼠股骨远端骨组织差异，发现与wt小鼠相比，pfn1 ^/mut小鼠的骨小梁数量减少且结构紊乱（图6a）。随后，研究人员利用trap对pfn1 ^/mut小鼠和wt小鼠破骨细胞进行染色，在pfn1 ^/mut小鼠干骺端检测到大量的多核trap阳性细胞，而在wt小鼠中破骨细胞数量很少（图6b）。接着利用免疫组化染色评估profilin 1在骨组织中的表达情况，结果显示：与wt小鼠相比pfn1 ^/mut小鼠的profilin 1蛋白表达显著降低（图6c），这与profilin 1的截短突变导致编码蛋白功能丧失一致。

综上，这项研究报告了pfn1基因的三种不同突变，包括两种截短突变和一种错义突变。上述突变位点导致了早发型pdb/gct严重的临床表型。建立的pfn1基因截短突变的小鼠模型表现出pdb样骨表型，证实了profilin 1蛋白功能缺失可能通过激活nf-κb通路，导致pdb/gct发生。在本研究中，证实pfn1截短突变小鼠为研究pdb相关病理机制的理想模型，将极大地帮助我们在未来揭示人类早发型pdb的病因和病理机制。同时这项研究也拓展了pdb的致病基因谱。pfn1基因突变的鉴定对于鉴别pdb中易发生gct的个体具有重要诊断价值，此外pfn1突变导致pdb/gct的确切分子机制还有待进一步研究。

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