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发稿时间：2021-04-02来源：天昊生物

一、数据分析发现gna14作为hcc潜在甲基化相关的肿瘤抑制基因

为了获得hcc最重要的潜在肿瘤抑制基因，作者分析了tcga和gse94660中的mrna表达数据及tcga的dna甲基化数据。从tcga甲基化数据中获得了535个差异甲基化基因（图1a），tcga表达数据中获取了1088个在hcc肿瘤组织中显著下调的基因（图1b）。对三个数据集取交集发现了两个重叠的基因gna14和tbx15（图1c），gna14表现出dna甲基化水平上调（图1d），而mrna表达下调（图1e），并且与hcc患者预后呈负相关，而tbx15并未显示出这一结果。因此，选定gna14作为hcc的研究对象。

二、gna14在hcc中表达显著下调

为了确定gna14在hcc中的表达，利用qrt-pcr对收集的临床配对样本进行表达定量验证，结果发现gna14 mrna表达在肿瘤组织中显著下调（图2a-b）。此外，多株hcc细胞系表现出gna14 mrna表达水平更低（图2c）。多个配对样本和细胞系的gna14蛋白水平同样显著更低（图2d-e）。roc曲线分析gna14在诊断tcga数据库（auc = 0.948）和本院hcc（auc = 0.935）中表现出较好的灵敏度和特异性（图2f）。免疫组化显示与匹配的正常组织相比，肿瘤组织中gna14表达降低（图2g）。此外，gna14的表达与临床特征相关，在本院hcc标本中，hbv感染组织（4.55倍）和血管侵袭组织（2.63倍）中gna14 mrna表达显著下调。在低分化组织（4.6倍）和复发患者组织（6.47倍）中，gna14表达也显著降低（图2h）。

三、hcc中gna14启动子呈高甲基化

为了探究gna14在tcga中的甲基化状态，使用shiny methylation analysis resource tool (smart)进行分析。结果发现gna14的三个探针（ch9.991104f，cg12687527和cg17301902）在肿瘤组织中显示出甲基化上调（图3a）。另外tcga数据显示gna14甲基化水平和mrna水平呈负相关（图3b），而且gna14高甲基化与hcc预后差相关（图3c）。利用methprimer（http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi）分析gna14启动子区域发现两个明显的cpg岛，对12对hcc样本检测这两个cpg岛的甲基化水平，通过dna甲基化测序发现其中一个cpg岛（基因组区域80262823-80262968）在肿瘤中呈高甲基化（图3d）。gna14 mrna表达水平与dna甲基化测序区域的甲基化水平同样呈现显著负相关（图3e）。肝癌细胞株（sk-hep-1，hcclm3，hep3b和plc/prf/5）和正常肝细胞株（l02，hepli5）也用于甲基化水平检测。甲基化测序结果显示，与正常肝细胞相比hcc细胞甲基化状态上调，特别是在sk-hep-1、hep-3b和plc/prf/5细胞中（图3f）。chip-qpcr分析显示，在sk-hep-1和hep3b细胞中，dnmt1和dnmt3a与gna14启动子区结合（图3g）。在sk-hep-1细胞中敲除dnmt1和dnmt3a后，甲基化测序显示cpg岛甲基化水平下调（图3h），而gna14蛋白表达升高（图3i）。用dna甲基化酶抑制剂5-氮杂胞苷刺激肝癌细胞系（sk-hep-1，plc/prf/5，hep3b，hcclm3，hepg2和huh7）48h后，除hcclm3外，gna14 mrna水平均显著升高（图3j）。dna甲基化测序结果显示，5-氮杂胞苷处理的肝癌细胞系（sk-hep-1, hep3b）的dna甲基化水平显著下调（图3k）。总结以上结果可以发现肿瘤中gna14表达的下调可能是由于其启动子区dna甲基化水平上调所致。

四、hbv编码的x蛋白（hbx）引起gna14启动子高甲基化

    tcga数据库显示，hbv感染患者gna14 mrna水平更低（图4a）。因此，检测了10例hbv感染患者和10例未感染患者肿瘤组织中gna14蛋白水平，发现hbv感染患者的gna14水平较低。另外hbv阳性的hcc组织gna14水平低于正常组织，而hbv阴性的hcc组织gna14水平不显著（图4b）。此外，smart分析tcga甲基化数据库发现gna14启动子（ch9.991104f，cg12687527，cg17301902）的甲基化水平与hbv感染相关（图4c）。hepg2.2.15是一种来源于hbv基因组dna感染hepg2后的hcc细胞系。与hepg2相比，hepg2.2.15中dnmt1和dnmt3a的蛋白和mrna表达量显著升高，而gna14的蛋白和mrna表达量下降（图4d）。hbx已被证实通过影响dnmts来调控dna甲基化，作者使用co-ip验证hbx与dnmt之间的关系，确认hbx与dnmt1、dnmt3a存在物理相互作用。而hbx与gna14之间无相互作用。敲低hbx后降低了hepg2.2.15细胞中dnmt1和dnmt3a的表达，但上调了gna14的表达（图4d-e）。将hbx过表达质粒转染hepg2细胞，观察到hbx过表达组dnmt1、dnmt3a上调，而gna14下调（图4d）。转染hbx过表达质粒后，用rna干扰敲除dnmt1或dnmt3a可挽救gna14的表达。同时敲除dnmt1和dnmt3a显著增加了gna14的表达（图4d）。双荧光素酶报告系统进一步探索了hepg2、hepg2.2.15、hcclm3和l02细胞中gna14启动子活性的变化（图4f）。除了野生型gna14启动子荧光素酶报告基因系统（wt）外，还构建了甲基化靶点缺失的突变型gna14启动子荧光素酶报告基因系统（mut，图4f）。在wt组中，与hepg2细胞相比，hepg2.2.15细胞中的启动子活性显著下调（图4g，左图）。但当目标甲基化位点发生缺失突变时，两种细胞系之间的差异消失了（图4g，右图）。当hbx在hepg2、hcclm3和l02中过表达时，gna14启动子活性下调，但当目标甲基化位点发生突变时，活性可以恢复（图4h）。作者还用sirna敲除hepg2.2.15细胞中的hbx、dnmt1和dnmt3a。在相应的敲除组中，gna14启动子的活性显著升高。然而，当靶dna甲基化位点发生缺失突变时，gna14启动子的活性变化被消除（图4i）。综上所述，hbx通过调控dnmt1和dnmt3a，影响gna14启动子的dna甲基化，导致gna14表达下调。

五、gna14抑制hcc增殖和转移

  为了研究gna14在hcc中的功能，研究人员首先利用hcc细胞系研究对细胞增殖的影响，结果发现gna14过表达显著抑制细胞活性，并且增加了g0/g1期细胞比例，降低了s期细胞比例，同时gna14过表达降低了克隆形成的数量。进一步研究gna14对肿瘤生长的影响，gna14过表达组的人肝癌裸鼠皮下移植瘤生长受到抑制，肿瘤大小和肿瘤显著降低。作者在研究中观察到gna14和notch1存在共定位的现象，因而，进一步通过实验证实了gna14通过促进notch1切割抑制了hcc增殖（图5）。

分析gna14对肿瘤转移的影响，发现过表达gna14显著抑制hcc细胞迁移和侵袭，小鼠体内实验同样表明gna14过表达与hcc转移减少相关。jmjd6蛋白可能与gna14存在相互作用，免疫荧光实验进一步证实了gna14和jmjd6共定位于hcc细胞的细胞质和细胞膜。gna14抑制hcc转移的作用可能通过抑制jmjd6的表达来实现（图6）。

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