郑大一附院心血管内科张金盈教授团队的最新研究成果发现，循环外泌体可通过发动蛋白在细胞间穿梭，并通过传递mir-193a-5p靶向调控acvr1，进而保护上皮细胞免受氧化应激损伤。该文章近期发表于细胞生物学领域高影响力期刊《journal of cellular and molecular medicine》上。天昊生物有幸承担了外泌体microrna二代测序和生信分析工作。
英文题目：circulating exosomes repair endothelial cell damage by delivering mir-193a-5p
中文题目：循环外泌体通过传递mir-193a-5p修复内皮细胞损伤
if: 4.486
发表单位：郑大一附院心血管内科
背景：循环外泌体传递micrornas参与了心血管疾病的发生和发展。循环外泌体如何参与急性心肌梗死（ami）恢复期内(3-7天)内皮损伤的修复仍不清楚。
方法和结果：对ami患者的循环外泌体(ami-exo)和健康对照组(normal-exo)的循环外泌体进行了提取。在体外和体内的研究表明，循环外泌体可以保护内皮细胞（huvecs）免受氧化应激损伤。同时，normal-exo表现出更好的保护作用。通过应用相关的抑制剂，发现循环外泌体通过发动蛋白在huvecs之间穿梭。循环外泌体的小rna测序分析和qrt-pcr显示mir-193a-5p在normal-exo中表达较高。进一步研究显示，mir-193a-5p是体外和体内保护内皮细胞的关键因素。生物信息学分析发现，活化素a受体i型（acvr1）是mir-193a-5p的潜在下游靶标，这一点被acvr1的表达和双荧光素酶报告实验所证实。acvr1的抑制剂显示出类似于mir-193a-5p的保护作用，且acvr1的过量表达可以减弱mir-193a-5p的保护作用。总而言之，这些发现表明，循环外泌体可以通过发动蛋白在细胞间穿梭，并传递mir-193a-5p，以保护血管上皮细胞免受氧化应激损伤。
●急性心肌梗死（ami）是最常见和最严重的血管疾病之一，它可以逐渐发展为慢性心力衰竭（chf）。
●ami后的内皮细胞损伤及其修复机制的研究一直是学术界的一个热点。
●循环外泌体参与了心血管疾病的发生和发展，这表明它们可以作为诊断和治疗心脑血管疾病的一个重要依据。已证明循环外泌体传递micrornas参与了心血管疾病的发生和发展，但循环外泌体如何参与到急性心肌梗死（ami）恢复期内(3-7天)内皮损伤的修复仍不清楚。
●患者循环外泌体提取：ami发病后3-7天恢复期患者5毫升的静脉全血样本，使用exoquick试剂盒（system biosciences，美国）收集外泌体。血液样本在4℃以3000g离心20分钟，在上清液中以4：1的比例加入exoquick试剂，反应30分钟。在1500g下离心30分钟后，将沉淀物悬浮在与血清体积相等的pbs中。纯化的循环外泌体溶液被储存在-80°c。
●循环外泌体鉴定：通过透射电子显微镜（tem）和醋酸铀染色来观察循环外泌体的形态特征。使用纳米粒子跟踪分析器（nanosight ns300）分析外泌体的直径分布和浓度。使用bca试剂盒（solarbio，中国）测定循环外泌体的蛋白质浓度。通过western blot检测外泌体表面标记物的表达情况。
●体外实验相关内容：huvecs细胞培养，h2o2损伤处理同时进行ami患者和健康对照来源的外泌体孵育；cck-8 检测测定活细胞计数；血管形成实验；划痕实验；transwell侵袭实验；外泌体荧光标记；体外循环外泌体的摄取能力检测； huvecs 细胞的mirna mimics 和质粒转染；外泌体的 mirna mimics转染；双重荧光素酶报告测定；免疫印迹等
●体内实验相关内容：颈动脉球囊损伤sd大鼠模型建立，将pbs或循环外泌体（normal-外泌体或ami-外泌体）滴在大鼠颈动脉表面，后续进行动脉组织学等检测●测序实验相关内容：ami恢复期患者（n = 6）和健康对照组（n = 3）的循环外泌体microrna测序和生物信息分析由上海天昊生物完成。
◆循环外泌体的生物学鉴定
从12名ami患者和9名健康人外周血中收集了外泌体，两组样本的外泌体特异性蛋白hsp70, alix表达差异不显著（图1a）; 基于电镜和纳米粒子跟踪分析器结果显示，两组样本的外泌体形态类似，直径分布都在50-150 nm，差异不显著（图1b-c）。
◆循环外泌体保护内皮细胞免受氧化应激损伤
1）huvecs细胞h2o2损伤处理同时进行ami患者和健康对照来源的外泌体孵育，cck-8 实验、血管形成实验均表明正常-exo（100μg/ml）和ami-exo（100μg/ml）都可以保护huvecs在24h内不受h2o2的损伤影响。此外，normal-exo显示出更好的保护作用（图2 a-b）。
图 2 (a) h 2 o 2 (600 μmoll) 和外泌体(normal-exo or ami-exo, 100μg/ml) 共同处理huvecs 细胞24 h。cck-8实验检测外泌体的保护作用(n = 3)。(b) huvecs在处理6小时后进行血管形成实验(n = 3)。
2）划痕实验、transwell侵袭实验均表明循环外泌体（100μg/ml）可以保护huvecs免受h2o2-诱导的氧化应激损伤（图2cd）
3）大鼠术后14天，内膜/中膜比率的定量分析显示，normal- exo（400μg/rat）和ami- exo（400μg/rat）都能显著减少机械损伤引起的新内膜增生,而normal-exo显示出更好的保护作用（图2e）
图2：(c) 将huvecs处理12小时，通过划痕宽度来检测循环外泌体保护作用（n = 3）。
(d) huvecs处理24小时，通过迁移的细胞数来检测循环外泌体的保护作用（n = 3）。
（e）将pbs或循环外泌体（normal-外泌体或ami-外泌体）滴在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中的颈动脉表面。图像为he染色的动脉横断面代表图像，右图展示内膜/中膜比率的统计结果。
◆循环外泌体通过发动蛋白（dynamin）在huvecs之间穿梭荧光显微镜检测显示，与对照组相比，dyansore（dynamin抑制剂）对循环外泌体的摄取有明显的、剂量依赖性的抑制作用，表明循环外泌体是通过dynamin被huvecs摄取的（图3a）。进一步使用transwell系统来验证这一功能，结果显示，下层细胞室的huvecs可以摄取染色的外泌体而不与上层细胞室的huvecs直接接触（图3b-c），表明循环外泌体可以在细胞间穿梭。
图3 循环的外泌体通过dynamin在细胞间穿梭。(a) 染色的外泌体在huvecs中的分布。红色：用pkh26染色的外泌体，蓝色：dapi。条形图表示50μm。(b) transwell系统的示意图。huvecs播种在上腔，与外泌体(100 μg/ml)共培养24小时。然后，将上腔室移到另一个下腔室中培养huvecs的跨孔系统。(c) 下腔室中huvecs的代表性荧光图像。
◆mir-193a-5p可能是循环外泌体中的关键保护因子
基于外泌体的microrna测序，差异表达结果见图4a。mir-193a-5p的差异结果通过rt-pcr得到了验证（图4b）。在huvecs细胞中转染mir-193a-5p mimic，可以显著保护h2o2对huvecs引起的损伤（图4c-d）。在大鼠动脉球囊损伤模型中，将mir-193a-5p mimic和阴性对照转染到ami-exo中，以证实mir-193a-5p确实在体内通过循环外泌体发挥作用。内膜/中膜比率的定量分析表明，mir-193a-5p对外泌体（400μg/rat）的保护作用至关重要（图4e）。
图4 mir-193a-5p对内皮细胞的保护作用。(a) normal-exo (n = 3)和ami-exo (n = 6)外泌体mirna差异表达热图。 (b) qrt-pcr验证mir-193a-5p 在外泌体中的表达情况 (normal-exo, ami-exo) (n = 3)。 (c) huvecs 细胞进行mimics negative control(nc) 或mimics of mir-193a-5p转染24h，后续进行h 2 o 2 (600 μmoll) 24 h处理。图示为cck-8 检测结果(n = 3). (d) huvecs 细胞进行mimics negative control(nc) 或mimics of mir-193a-5p转染24h，后续进行h 2 o 2 (600 μmoll) 6 h处理。图示为血管形成检测结果 (n = 3)。 (e) nc 或 mimics of mir-193a-5p转染后的ami-exo 滴注在大鼠颈总动脉球囊损伤模型中的颈动脉表面。图示为he染色的动脉横断面代表图像和内膜/中膜比率的统计结果 (n = 5)。
◆avcr1作为mir-193a-5p的靶基因，参与保护内皮细胞1）
针对mir-193a-5p的靶基因进行go和kegg通路富集分析，最显著的通路为plasma membrane adhesion molecules managing homophilic cell adhesion（图5a）。这个通路的一个基因，激活素a受体i型(acvr1)，也被称为激活素受体样激酶2(alk2)，在细胞功能和增殖方面得到了深入的研究。因此，被选为可能的靶基因进行后续研究。2）免疫印迹检测该基因在mir-193a-5p mimic转染后的huvecs细胞中显著低表达(图5d)。双荧光报告酶系统也证明 acvr1是 mir-193a-5p的靶基因 (图 5e)。
图5 mir-193a-5p的下游靶标研究。mir-193a-5p的潜在下游靶标的go分析(a)和kegg分析(b)。(c) 预测的acvr1和mir-193a-5p的序列结合靶区。(d)转染了nc或mir-193a-5p 的huvecs中的acvr1和β-肌动蛋白表达水平（n = 3）。(e) 将人acvr1 3'-utr或其突变的质粒载体转染到293t 细胞，然后用mir-193a-5p模拟物或其nc进行转染，后续进行双重荧光素酶活性测定（n = 3）。
3）在huvecs细胞中进行acvr1抑制剂处理，在cck8实验中，acvr1的抑制剂在huvecs中显示出与mir-193a-5p相同的保护作用，并且这种作用影响是浓度依赖的（图6a）。血管形成实验和划痕实验也证实，抑制acvr1可以减少氧化应激引起的对内皮细胞功能的损伤（图6b-c），表明acvr1在内皮细胞功能中的重要作用。cck8检测和血管形成实验都表明 mir-193a-5p的靶基因acvr1的过量表达，可以逆转mir-193a-5p的血管保护作用（图6e-f）。
图6 acvr1是mir-193a-5p的保护作用的一个关键因素。h2o2 (600 μmo/l) 和acvr1的抑制剂(alk2-in-2) (concentration at 3, 9, 27, 50 and 100 nmol/l) 共同处理huvecs细胞24 h，然后进行cck-8 检测(n = 3). (b) huvecs 细胞进行h2o2(600 μmol/l) 和 alk2-in-2 (27 nmol/l) 6h处理,然后进行血管形成检测(n = 3). (c) huvecs 细胞进行 h2o2(600 μmol/l) 和 alk2-in-2 (27 nmol/l) 12h处理,然后进行划痕实验检测(n = 3). (d) huvecs 细胞进行转染，分组包括mimics of mir-193a-5p negative control plasmid (mimics pex-3.nc) ； mimics of mir-193a-5p acvr1 overexpression plasmid (mimics pex-3. acvr1). 转染24h后wb检测acvr1和gadph的蛋白水平. (e) huvecs细胞进行d中的转染后，进行24hh2o2处理，然后进行cck-8检测 (n = 3). (f) huvecs细胞进行d中的转染后，进行6h h2o2处理，然后进行血管形成检测 (n = 3).
下图为该研究提出的循环外泌体对氧化应激损伤保护作用的可能机制：循环外泌体可以通过dynamin在细胞间穿梭，并通过传递mir-193a-5p来介导acvr1信号途径，从而保护内皮细胞免受氧化应激损伤。
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