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发稿时间：2022-10-08来源：天昊生物

英文题目：faecalibacterium prausnitzii attenuates ckd via butyrate-renal gpr43 axis

中文题目：普拉梭菌通过丁酸-肾gpr43轴减轻慢性肾病

期刊名称：circulation research

发表日期：2022-9-27

影响因子：23.213 (一区top)

慢性肾脏病(ckd)是世界范围内最重要的公共卫生问题之一，由于其在疾病早期没有症状，对ckd的预防或治疗仍具挑战。由于目前治疗ckd仅限于透析和肾移植，成本高昂，急需发展新的更优的治疗方法。

最新研究表明，肠道菌群在ckd的发生发展中发挥着重要作用，但对于特定的肠道菌群及其代谢物是否可以作为ckd的潜在治疗药物仍存疑问。普拉梭菌（faecalibacterium prausnitzii）是一种产丁酸盐的有益细菌，具有促进肠道内环境稳定的抗炎特性，但没有报道对普拉梭菌是否是ckd的原因或影响进行研究。因此，本研究旨在首先确定在代表西半球和东半球患者的ckd人群中是否持续缺少普拉梭菌。进一步评估补充普拉梭菌是否能够改善肾功能，并对其可能机制进行探讨。

本实验利用美国肠道项目(prjna797660)测序数据，以及利用天昊生物16s扩增子测序服务，对105名中国独立人群（包括30名健康志愿者、32名临床诊断为无高血压的ckd患者和43名患有高血压的ckd患者(ckd-htn)）进行了粪便16s扩增子检测，分析肠道菌群多样性。还利用gc-ms对血浆和粪便中的短链脂肪酸(scfas)水平及一系列毒素进行了测定。

本研究通过对小鼠肾脏显微注射腺相关病毒构建了动物模型，并通过补充普拉梭菌来研究其对ckd小鼠肠道菌群、scfas及对丁酸盐受体gpr的影响。

研究首先比较了来自美国肠道计划项目中的283名ckd患者和294名非ckd患者（non-ckd）的肠道微生物16s扩增子数据，发现粪杆菌属在非ckd中富集(图1a)，类杆菌属（bacteroides）在ckd中富集(图1b)。

中国ckd人群中的菌群失调和粪杆菌属的减少

本研究对105名中国的独立人群进行了粪便16s扩增子检测，其中包括30名健康志愿者、32名临床诊断为无高血压的ckd患者和43名患有高血压的ckd患者(ckd-htn)。结果同样发现，粪杆菌属在健康对照组中富集，而在ckd-htn组中显著减少(图1c)，以及ckd和ckd-htn中类杆菌的丰度增加(图1d)。与健康对照组相比，ckd-htn患者的f/b(厚壁菌门/拟杆菌门)比值较高，这是肠道生态失调的一个特征(图1e)。与健康对照组相比，ckd和ckd-htn患者α多样性的参数(即观察到的特征、chao1丰富度和shannon多样性)较低(图1f-1h)。

图1、美国肠道计划数据库和中国ckd人群中粪杆菌属较少。

为了研究肠道菌群的变化是否与ckd的临床特征相关，本研究使用spearman评估了多种菌属丰度与收缩压(sbp)、舒张压(dbp)、血尿素氮(bun)、血清肌酐(scr)、尿酸(ua)、估计的肾小球滤过率(egfr)、总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl)以及低密度脂蛋白(ldl)之间的相关性，发现粪杆菌属与ua、bun、scr和ldl呈负相关，与egfr、tc和hdl呈正相关(图2a)，这些表明粪杆菌属在肾功能中的作用。

ckd患者血清中短链脂肪酸降低（scfas），脂多糖和三甲胺n-氧化物升高

由于肠-肾轴在高血压和ckd中的重要作用，本研究对几种微生物群衍生代谢物的血清水平进行了分析。三甲胺n-氧化物（tmao）是一种通过肠道微生物代谢从膳食磷脂酰胆碱或肉碱产生的分子，在ckd-htn中明显高于ckd和对照组(图2b)。在ckd-htn患者的血清中，脂多糖(lpsc，一种革兰氏阴性菌的内毒素)的水平最高(图2c)。丁酸盐是粪杆菌属产生的一种主要代谢产物，在ckd和ckd-htn中均有所减少(图2d)。此外，ckd和ckd-htn患者的乙酸盐水平降低(图2e)。与对照组相比，在ckd-htn组中发现丙酸盐较少(图2f)。

图2、中国人群3组中的菌属与临床特征相关性分析。

普拉梭菌改善ckd小鼠的肾功能障碍和纤维化

通过上述实验，研究者假设补充普拉梭菌这个粪杆菌属中唯一菌种，将可能改善ckd小鼠动物模型中ckd相关的病理生理学指标。因此，实验通过5/6 nx手术在小鼠中诱导ckd 4周，随后每周3次用200μl 2×10⁸ cfu的普拉梭菌或对照pbs进行灌胃，持续16周(图3a)。与假手术组相比，ckd组表现出bun(图3b)和scr(图3c)水平升高。此外病理染色等实验也表明，与对照组相比，普拉梭菌治疗减轻了ckd的病理进展。

图3、普拉梭菌(fp)改善了ckd小鼠的肾功能障碍和纤维化。

接下来研究发现在ckd小鼠中观察到巨噬细胞的肾浸润增加，普拉梭菌治疗改善了巨噬细胞浸润。与此相一致，5/6 nx诱导的ckd小鼠肾皮质中mcpt1、il1b和il6的上调mrna水平通过普拉梭菌治疗得到部分缓解。

本研究还通过测定3种微生物来源的毒素(对甲酚硫酸盐pcs、对甲酚硫酸盐is和三甲胺n-氧化物tmao)和3种非微生物依赖性尿毒症毒素(不对称二甲基精氨酸adma、对称二甲基精氨酸sdma和胍基琥珀酸(gsa))的水平，证明普拉梭菌治疗可以改善ckd小鼠的循环尿毒症毒素。

普拉梭菌改变了ckd小鼠的肠道微生物组成

本研究接下来检测了普拉梭菌治疗的有益效果是否因改变ckd相关肠道菌群。结果发现，普拉梭菌治疗显著增加了observed features、chao 1和shannon多样性(图4)。在pcoa中，形成了4个簇，普拉梭菌治疗显著改变了微生物群。在属的水平上，ckd组中比对照组中的脱硫弧菌属（desulfovibrio）和柯林斯菌属（collinsella）更丰富，而粪杆菌和罗氏菌属（roseburia）更少。经过16周的治疗后，脱硫弧菌属和柯林斯菌属的平均丰度下降，并增加了ckd小鼠中罗氏菌属和粪杆菌属的平均丰度。这表明普拉梭菌改变了肠道微生物群，使其趋向多样性和稳态的平衡。

图4、普拉梭菌改变了ckd小鼠的肠道微生物组成。（原文图s3）

普拉梭菌改善ckd小鼠的肠道炎症和通透性

肠道炎症和屏障损伤的增加有助于慢性肾病的发病机制。因此，本研究分析了普拉梭菌治疗对肠道炎症和通透性的影响。与假手术组相比，ckd诱导ckd组近端结肠的mcpt1、il6、il1b、tlr2和tlr4的基因表达增加。普拉梭菌治疗降低了ckd fp组近端结肠相关基因的转录水平。对于肠通透性，实验进行了(1)紧密连接蛋白的rt-pcr；(2)口服灌胃fitc-葡聚糖，30天后进行评价它在血浆中的水平；(3)血浆中i-fabp的elisa等，结果确实发现普拉梭菌可以改善ckd小鼠的肠道炎症和通透性。

普拉梭菌对普拉梭菌小鼠血浆和粪便中scfas产生的影响

普拉梭菌是一种可以产生丁酸盐的菌种。为了阐明普拉梭菌肾保护作用的潜在机制，研究者分析了所有4组小鼠的scfas水平。与假手术小鼠相比，在ckd小鼠的粪便和血浆中观察到较少的丁酸盐。普拉梭菌增加了粪便和血浆中的丁酸盐水平。未发现普拉梭菌对乙酸盐或丙酸盐的影响。这些结果表明，丁酸盐产量的增加可能是该菌肾脏保护作用的主要机制。

普拉梭菌增加ckd小鼠gpr- 43的表达

为了进一步研究普拉梭菌介导的肾脏保护作用是否是通过丁酸盐实现的，研究者评估了丁酸盐受体gpr-43、gpr-109a和gpr-41的表达。gpr43的基因表达在ckd中较低，但在ckd小鼠的肾组织中被普拉梭菌治疗挽救，这表明产生丁酸盐的普拉梭菌的肾脏保护作用可能是通过丁酸盐与其受体gpr-43结合的过量有效性。gpr-43的免疫组织化学染色显示，在ckd小鼠和ckd患者中，gpr-43在肾小管上皮细胞和肾足细胞中表达一致。免疫荧光染色也证实aqp-3(肾小管上皮细胞的标记物)阳性和wt-1(足细胞的标记物)阳性细胞表达gpr-43。

普拉梭菌通过丁酸盐-gpr-43途径减少肾脏炎症

接下来，研究在肾小管上皮细胞tcmk-1和肾足细胞mpc-5中建立了脂多糖诱导的炎症的体外模型，以测试普拉梭菌是否具有肾脏抗炎作用，因为肾脏炎症是ckd不同阶段的标志。在这两种细胞系中，实验证实了脂多糖诱导的促炎性il1b和il6的过表达被普拉梭菌和丁酸钠的培养上清液所抑制。为了证明gpr-43在普拉梭菌和丁酸盐介导的肾脏炎症抑制中的作用，使用sirna敲除gpr-43，并通过tcmk-1和mpc-5中的western blot证实(图6b和6c)。在脂多糖处理的tcmk-1和mpc-5细胞中，gpr-43敲除阻断了普拉梭菌介导的il1b和il6 mrna水平的下调。

通过gpr-43改善慢性肾病小鼠的肾功能障碍和炎症

为了确定普拉梭菌介导的肾脏保护作用是否通过gpr-43，研究者使用携带靶向小鼠gpr43编码序列的短发夹状rna的腺病毒，敲除了小鼠肾脏中的gpr-43(图5a)。免疫荧光染色证实了肾脏中gpr-43的敲低。如图5b和5c所示，在ckd小鼠中，gpr-43敲除阻断了通过普拉梭菌治疗降低的bun和scr。通过染色实验也确定相似结果。 gpr-43敲除抑制了通过普拉梭菌治疗减轻的肾纤维化(图7d和7e)和肾小管损伤(图7d和7f)。肾中gpr-43的敲低阻断了经普拉梭菌处理后f4/80阳性染色的减少(图7d和7g)。肾中几个炎症基因的mrna表达减少，包括mcpt1(图7h)、il1b(图7i)和il6(图7j ),也受到gpr-43敲除的抑制。

图5、普拉梭菌(fp)通过gpr(g蛋白偶联受体)-43改善ckd小鼠的肾功能障碍和炎症。（原文图7）

丁酸盐通过gpr-43改善慢性肾病小鼠的肾功能障碍和炎症

为了进一步确定普拉梭菌的有益作用是否是由于肾脏中丁酸盐和gpr-43信号的增加，研究者使用aav敲除了gpr-43的表达，并给予ckd小鼠丁酸钠治疗(图6a)。4周后，通过用aav载体转导，肾gpr-43表达被敲低(图6b和6c)。gpr-43敲除阻断了ckd小鼠中丁酸盐介导的bun(图6d)和scr(图6e)的改善。染色结果也显示gpr-43敲除抑制通过丁酸盐治疗减轻肾脏的纤维化(图6f和6g)和肾小管损伤(图6f和6h)。研究还发现，通过丁酸盐处理，gpr-43敲除阻断了肾脏中降低的f4/80阳性染色(图6f和6i)和mcpt1(图6j)、il1b(图6k)和il6(图6l)的mrna水平。综上所述，本研究结果表明，普拉梭菌对肾脏炎症和功能障碍的保护作用是通过丁酸盐-gpr-43途径发挥作用的。

图6、丁酸盐通过gpr (g蛋白偶联受体)-43改善ckd小鼠的肾功能障碍和炎症。（原文图8）

本研究的重要发现包括：(1)在两个独立的人群中验证了作为标记的普拉梭菌的减少；(2)首次在小鼠模型中证明了普拉梭菌能减轻肾脏炎症，减少尿毒症毒素，并延缓ckd的进展；(3)证实在小鼠ckd模型中，普拉梭菌纠正了肠道生态失调，恢复了肠道稳态；和(4)说明普拉梭菌来源的丁酸盐通过gpr-43发挥肾脏保护作用，这有助于其对ckd的有益作用。考虑到ckd发病率和相关死亡率的全球增长，以及ckd预防和有限治疗方案的挑战，本研究在小鼠中的研究提出了一种利用共生菌普拉梭菌作为益生菌治疗ckd的新方法。